CROMATOGRAFIA
La
cormatografia és una tècnica que serveix per separar barreges de molècules, al
igual que l´electroforesi. Però mentres
que l´electroforesi necessita petites quantitats, la cromatografia permet grans
quantitats. És una tècnica preparativa dels productes. Normalment es
purifiquen.
La
cromatografia utilitza unes substàncies o resines que s´enganxen al substracte
que volem. Hi ha molts tipus de cromatografia:
1. Gel filtració:
separa les substàncies en funció del seu tamany. Es realitza a unes columnes de
vidre a les que es col·loquen unes resines que tenen uns canals molt ramificats
amb un diàmetre de porus determinat.
Les molècules grans mai no
podran traspasar pels canals i sortiran ràpidament del tub. Si les molècules
són petites, entren dins del porus i fan un camí més llarg que les molècules
grans. Aquest tipus de cromatografia també permet, a més, saber quin és el
tamany concret d´una proteïna. Si es col·loca una proteïna coneguda ies fa una
gràfica:
Es fa una recta de regressió i es pot esbrinar quin és el pes molecular
coneixent quan ha sortit. Es coneix on es troba la proteïna per
espectrofotometria.
2. Capa fina: No
s´utilitza una columna de vidre, sino una placa d´alumini sobre la que hi han
molècules de silicat hidratades. Permet separar molècules de petit tamany en
funció de la seva polaritat. Es col·loca una gota de la substància a la placa
d´alumini i es col·loca a un recipient amb una solució d´alcohol. L´alcohol
comença a pujar per capilaritat, de
forma que ens arrastrarà els aminoàcids que hi ha a la barreja. Els aminoàcids
pugen perquè si tenim un aminoàcid apolar, es dilueixen fàcilment en una
solució i arrastrarà fàcilment els aminoàcids que siguin apolars. Els altres
aminoàcids, com a la capa fina tenen càrrega, l´aigua els fa frenar i els
aminoàcids apolars es queden a la zona baixa i tots els apolars es troben a
dalt. Entremig es trobaran ordenats per polaritat els aminoàcids. La taca del
principi s´haurà distribuït en més o menys troços. Els aminoàcids s´han de
tenyir mitjançant la ninhidrina. La grandària i intensistat de la taca és
proporcional a la concentració d´aminoàcids.
3. Intercanvi
iònic: separa barreges de molècules en funció de les càrregues. Es fa a
columnes de vidre que s´empaqueten amb resina amb unes esferes amb càrrega
superficial possitiva i negativa. Quan són possitives, són cromatografies per
intercanvi catiònic. Quan són negatives, són cromatografies per intercanvi
aniònic.
Són barreges de proteïnes amb iguals tamanys i diferents càrregues. Les
proteïnes avançaran a la columna i seran recollides, mentre les proteïnes
avancin, si l´intercanvi és aniònic, les molècules negatives cauran i les
molècules possitives estaran enganxades a l´interior del tub. Per separar les
que molècules que volem que són les que s´han quedat, es deixa un tub net i
s´afegeix NaCl de forma que el Na+ s´enganxa a la resina i les
proteïnes són recuperades. També es pot fer variant el PH. Es pot aconseguir que la proteïna es transformi i caigui.
Si la sal es va afegint gradualment, les proteïnes enganxades van sortint
gradualment.
4. Cromatografia
d´afinitat: pretén separar diferents molècules mitjançant la separació de la
molècula que nosaltres volem. A la columna es col·loca una resina que s´enganxa
a la molècula que nosaltres volem. Surt tot el que no volem i es queda
enganxada la nostra proteïna. Tenen un poder de separació molt gran. No es
poden fer servir amb barreges molt complexes. La proteïna es desenganxa
mitjançant afegint una solució de sal que debilitat les interaccions que s´han
format. També es pot fer variant el PH.
5. Precipitació
per sal: permet separar una barreja de proteïnes en funció de la seva
polaritat. Es basa en que si tenim una sèrie de proteïnes en dissolució, estan
interaccionant amb l´aigua formant ponts d´hidrògens i algunes tindran més afinitat per l´aigua formant
enllaços i altres seran més hidrofòbiques i més insolubles. Si s´afegeix una
sal, la sal sagrestarà les molècules d´aigua que interaccionen amb les proteïnes.
Amb les proteïnes molt solubles no passa res però a les hidrofòbiques, pot ser
suficient per deixar d´establir ponts d´hidrògen a l´aigua i que precipitin cap
al fons del recipient. Amb més sal, les següents proteïnes en l´escala de
proteïnes també cauran. Hi ha un bon mètode de separació amb el criteri de
polaritat. Si es treu el sobrenedant, el sediment serà bàsicament la proteïna.
6. Centrifugació:
quan les proteïnes precipiten, la gravetat actúa i fa que caigui. Aquesta
caiguda pot accelerar-se amb la centrifugació. La centrifugació incrementa la
força de la gravetat de forma que la força de caiguda s´accelera. Els factors
que acceleren la caiguda són:
· Densitat: com
més densa, abans cau.
· Forma.
· Viscositat del
medi: com més viscós, més tarda.
· Acceleració
dels sistema: com més r.p.m. més força de gravetat i menys temps.
7. Diàlisi: quan
hi ha una barreja de proteïnes amb un alt contingut de sal, per eliminar la sal
hi ha varis mètodes, entre ells la diàlisi. Es fica la mostra a un recipient
amb 2 membranes amb un determinat diàmetre de porus, de forma que les proteïnes
que hi ha dins les membranes no podran sortit, mentre que els ions sí. Si es
col·loca a un recipient amb 1000 vegades més el volum de líquid, al cap d´una
estona hi haurà la mateixa concentració de sal dins del recipient petit que
fora. Si es repeteix, tornarà a equilibrar-se la concentració d´ions i es pot
continuar repetint. El líquid ha de ser el mateix al recipient gran i al petit.
TRENCAMENT DE
TEIXITS
Per purificar
una proteïna, primer s´han de trencar els teixits o cèl·lules on es troben les
proteïnes i després es fa la purificació.
Si es tracta de
bacteris: es pot trencar mitjançant un bany maría que fa que es trenquin les
membranes i s´alliberi el contingut a l´exterior. Però es produeixen proteïnes
desnaturalitzades. També es pot utilitzar el lisozim, que degrada la paret dels
bacteris i després es col·loca a una solució hipotònica i es provoca que la
pressió interna de la cèl·lula faci explotar la membrana i la proteïna surti a
l´exterior. Els ultrasons emeten unes freqüències molt altes i es provoca un
trencament de les membranes.
A les cèl·lules
vegetals o llevats, la paret celular és més resistent i s´ha d´afegir unes
boles de vidre a un tub i somètre-les a una força mecànica que, mitjançant els
xocs de les boles, es trenquen moltes cèl·lules i alliberen el contingut
celular. També hi ha enzims específics que degraden la paret i mitjançant un
xoc hipotònic es fa esclatar la cèl·lula.
A les cèl·lules animals, er trencar-les, s´ha
de disgregar les cèl·lules mitjançant un politron (túrmix) i mitjançant un xoc
hipotònic directe es trenquen.
Exemple de purificació de proteïnes:
Si volem una proteïna de 60.000 D (bastant normal)
que és una proteïna humana que es fabrica biotecnològicament mitjançant l´Echerichia
coli i és una proteïna força polar però normal i es tenen anticossos. El
procediment per purificar-la seria:
1. Trencament de E. coli mitjançant lisozima.
Dins del llisat hi ha tots els components de la cèl·lula.
2. Mitjançant la centrifugació es separa la proteïna
dels orgànuls. Com no se sap on es troba, s´utilitza l´electroforesi dels 2
tubs. Després es fa un Western Blot amb l´anticos i es busca on es troba la
banda marcada.
3. S´agafa l´extracte cru i s´apliquen diferents
cromatografies.
Inicio.
 |
