TÈCNIQUES
DE DNA RECOMBINANT
1. PLÀSMIDS: Es
va descobrir que a l´interior dels bacteris, apart del nucli, hi haurà petites
molècules de DNA, tancats, que si és mirava la seva seqüència, tenia un origen
de replicació que els permet replicar-se. Aquests plàsmids normalment portaven
un gen que donava resistència a un antibiòtic. Produeixen proteïnes capaces de
trencar les molècules d´antibiòtics.
2. ENZIMS DE
RESTRICCIÓ: Es va descobrir que hi havia unes proteïnes amb propietats
especials (eren capaces de tallar el DNA per seqüències concretes, que solen
ser seqüències palindròmiques (cap i cua). Es poden llegir de 3´a 5´o de 5´a
3´i tenen la mateixa seqüència:
El tall pot ser
de dos tipus:
-DNA, un cop
tallat, amb extrem llisos (tall net).
-DNA, un cop
tallat, amb extrems cohesius (tall amb biaix). En qualsevol moment es poden
unir perquè les seqüències són complementàries.
Les bactèries
per defensar-se dels DNA dels fags, utilitzaven els Enzims de restricció per
inutilitzar el DNA extrany. Cada bacteri té el seu Enzim de restricció. Els
enzims de restricció tenen un nom de 3 parts:
Gènere Espècie Cognom = Soca
E. Co RI
3. LLIGASA DEL
DNA: Es va veure que el fag per defensar-se del mecanisme de defensa, a més del
DNA, afegia unes proteïnes que tornaven a unir els fragments. En aquesta lluita
guanya l´enzim que treballi més ràpid (velocitat enzimàtica més elevada). La
lligasa del DNA pot unir DNA llisos o DNA cohesius. Refa l´enllaç covalent que
s´ha perdut. Als extrems llisos tant fa els extrems que uneixi, mentre que als
cohesius per poder-se unir han de ser trencats per 1 mateix enzim.
4.
PURIFICICACIÓ DE PLÀSMIDS: es va veure que els plàsmids es podien purificar.
Primer s´ha de trencar els bacteris i després s´ha de passar per cromatografies, centrifugacions,
electroforesi... i quedar-se amb el DNA plasmídic. Els plàsmids es poden
manipular. Aquesta tècnica, a més es poden reintroduir a bacteris
(transformació bacteriana). Es poden afegir plàsmids a bacteris que no el tenen
mitjançant Cl2Ca a baixa temperatura, els bacteris els adquireixen al cap d´una estona. Als 30
minuts hi ha bactèries amb o sense plàsmid. Es sap mitjançant la col·locació de
les bactèries en una placa de petri amb antibiòtic (ampicilina normalment) pel
plàsmid que busquem. Només les que tenen el plàsmid desitjat, podran
desenvolupar colònies. Cada cèl·lula amb plàsmid s´anirà dividint, formant una
mena de muntanyes, colònies. Totes provenen d´una sola cèl·lula que s´ha anat
dividint tants cops que fins i tot es veuen a simple vista.
5.
GENOTEQUES: Es poden construir
genoteques mitjançant aquestes tècniques. Una genoteca és una colecció de gens
d´una espècie determinada. S´ha d´especificar l´espècie, el teixit...
Aquests
cromosomes estan molt replegats i s´ha d utilitzar un enzim de restricció.
Hemofilur
influence Soca
H in d III
L´enzim que
quan trobi una seqüència seva farà un tall i els talls són a l´atzar. Si els
extrems són cohesius. Aquest tub es guarda a la nevera i es fa una purificació
de DNA plasmídic. Acaben tenint el DNA plasmídic. Aleshores es tallen els
plàsmids mitjançant el mateix enzim. Els plàsmids actualment estan codificats
genèticament i només es trenquen per un únic punt.
Quan es barregen
els 2 tubs, hi ha una barreja de DNA que té com a peculiaritat que els extrems
són complementaris perquè són cohesius. Si a la barreja s´afegeix la TA
lligasa, hi ha vàries possibilitats:
-Que el plàsmid incorpori un fragment de
DNA genòmic.
-Que el plàsmid es torni a tancar.
-Que agafi extrems de DNA genòmic i es
tanqui sobre la mateixa molècula.
A nosaltres ens
interessa tenir els fragments del genoma humà a l´interior d´un plàsmid.
Per introduir
els plàsmids dins de les bactèries es fa la barreja amb Cl2Ca i
s´espera 30 minuts, es col·loquen a un medi de cultiu i les colònies podran tenir un plàsmid normal o un plàsmid amb un
fragment de genoma. Aleshores, mitjançant un mètode de color, s´aconsegueix una
placa de cultiu amb bacteris que tenen un plàsmid a l´interior, que conté un
fragment de DNA.
Recerca de
genoteques
Per buscar els
gens que ens interessen, es pot fer per vàries estratègies. Es marca un gen
conegut u s´utilitza com a sonda. Primer es separen les cadenes de DNA
mitjançant calor (94ºC durant varis minuts). Després s´imita el procés de
replicació in vitro. S´agafa la DNA polimerasa, s´afegeixen nucleòtids
(A,C,T,G) i uns primers. Una part d´un dels nucleòtids és radiactiu. Segons
l´atzar es col·loquen més o menys radiactives. A la síntesi hi haurà unes
cadenes filles, que de tant en tant, presentaran un nucleòtid radiactiu.
Després es tornen a separar altre cop les cadenes i hi ha una cadena marcada i
altre no marcada.
Es fa una placa
de cel·lulosa on es copien les cèl·lules. Després s´afegeix NaOH i es trenquen
les cèl·lules. Es col·loquen dins de les boses i a més, a dins la bossa es
col·loquen les sondes. Si les sondes troben seqüències semblants a la seva,
s´enganxarà.
Si la colònia
té un gen semblant a la sonda, s´enganxa. Després s´agafa el paper i es
col·loca una placa fotogràfica i, si la sonda és radiactiva, mostrea uns
puntets negres. Aleshores ja es coneix on es troben.
Inicio.
 |
