ELECTROFORESI
L´electroforesi
calcula la quantitat de proteïnes que hi ha en sang. És un signe diagnòstic
molt freqüent. Per fer això, servirien les tècniques espectrofotomètriques,
però potser només volem valorar unes determinades. De vegades interessa separar-les
en les diferents agrupacions i després valorar les que només ens interessa.
L´electroforesi
separa molècules més o menys similars i permetrà quantificar-les.
TIPUS
· Electroforesi
d´acetat de cel·lulosa: són làmines de plàstic molt primes i a sobre una capa
de paper. Tenen una forma rectangular i una mica rígida. Serveixen per separar
i quantificar les diferents concentracions de proteïnes en sang. Es separen les
proteïnes del sèrum del pacient i
després es col·loca a una cubeta d´electroforesi. La cubeta d´electroforesi és
una mena de palangana que al mig té una divisió en 2 compartiments estancs.
S´omple cada compartiment amb una solució tampó amb un PH bàsic. S´agafa la tira reactiva de tal forma que superi
la columna del mig i faci contacte entre els 2 compartiments. S´aplica un camp
elèctric en el que l´electricitat no pot passar d´un costat a l´altre si no és
mitjançant la tira d´acetat de cel·lulosa. Com la majoria de biomolècules estan
separades, intentaran migrar cap al pol possitiu, en funció de la càrrega que
utilitzin per equilibrar-se. Es separen en
funció del punt isoelèctric. Després hi ha una sèrie de bandes que
corresponen a diferents proteïnes. Abans de veure-les s´ha de fer una tinció
mitjançant el negre amido, que fa que apareguin les bandes de color negre. Es
fa córrer un sèrum del pacient control i una del pacient malalt i es comparen.
Aquesta tècnica és el proteinograma. Majoritàriament hi ha una banda més
grossa, que és l´albúmina, després venen les a-globulines,
després les b-globulines i per últim les c-globulines. És la tècnica més utilitzada a clínica. La mostra sempre es col·loca al pol negatiu.
· Electroforesi
de gel d´agarosa: Una corrent elèctrica ha de traspassar un substracte de gel
d´agarosa. Per sobre els 70ºC es torna líquida i als 30-35ºC es gelifica.
L´estructura interna del gel és una xarxa de molècules molt porosa. Un cop fosa
es posa a un motlle. La mostra es col·loca als forats que es fan amb la pinta
dins del motlle. Aquest gel es col·loca a una cubeta d´electroforesi. Es
col·loca una solució tampó i lúnic pas de la corrent es dóna a través del gel.
Permet separar molècules d´àcids nucleics (ADN i ARN). Es col·loca cert volum
dins del pou i s´aplica un corretn elèctric. Totes les molècules de DNA tenen
la mateixa càrrega. La relació entre la masa de la molècula i la càrrega és la
mateixa. Aquesta relació és idèntica i es mouen amb la mateixa intensitat cap
al pol possitiu. Les molècules més petites que travessaran més ràpidament el
gel, mentre que les més grans es veuran més retrasades. Ens permet separar les
molècules en funció del seu tamany. S´ha de fer un procés de tinció i
destinció. El colorant és el bromur d´etidi, que és fluorescent. Les molècules
de RNA són molècules monocatenàries i, de vegades, formen estructures
secundàries de la unió de nucleòtids complementaris. Tenint la mateixa
molècula, una forma desplegada és més difícil de que passi que una plegada, que
és més petita. Per evitar que ens doni dues bandes, es col·loca un reactiu
(formamida i formaldehid) que s´afegeixen al gel quan s´està solidificant, de
forma que totes estaran desplegades i es classificara en funció del tamany.
·
Poliacrilamida: Serveix per separar àcids nucleics i proteïnes. Estan composats
per 1 monòmer (acrilamida) que polimeritza i dóna una consistència de gel, però
la xarxa és més estructurada amb un diàmetre de porus molt concret i permet la separació de tamany més selectiva.
Té una resolució més alta.
Les proteïnes
es separen en diferents tamanys. S´ha de fer tinció mitjançant negre amido,
però sobretot es fa per blau de comassie, que té un pes molecular més baix per
travessar la xarxa. Les proteïnes només se separen per tamany si afegint SPS
(detergent iònic) per trencar la conformació secundària, terciària i quaternària
a l´espai. El SPS s´uneix de forma covalent a les proteïnes de forma que les
càrregues entre elles es desplacen i estiren la proteïna.
Les proteïnes
poden tenir una càrrega possitiva o negativa i la relació càrrega-massa és
igual. Els gens de poliacrilamida poden ser en presència (+SPS) d´SPS o
absència de SPS (-SPS), però deixen de ser inactives. Si es volen separar
molècules de DNA sempre serà en absència de SPS.
· Electroforesi
per electroenfocament: Serveix per separar proteïnes. És una electroforesi de
poliacrilamida en absència de SPS a la que hem afegit amfolits, que creen un
gradent de PH, al llarg del gel de poliacrilamida. S´aconsegueix que a una
barreja de proteïnes, quan s´apliqui el camp elèctric es separaran en funció
del punt isoelèctric. Els aminoàcids amb PH àcid tenen càrrega possitiva. A un
ambient bàsic, els aminoàcids no tindrien càrrega. Cada proteïna té el seu punt
isoelèctric (punt al qual la càrrega neta de la proteïna és igual a 0 en aquell
punt). Quan arriben al punt isoelèctric es queden clavades fins que donen una
línia molt fina. Sempre s´han de tenyir.
· Electroforesi
bidimensional. Hi ha electroforesis de 2 dimensions on hi ha una barreja
complexa de proteïnes, on si apliquem un electroenfocament, surten 100 bandes
com a molt, que són una barreja de proteïnes i, a cada banda hi ha proteïnes
amb el mateix punt isoelèctric. Després es separen per tamany en presència de
SPS, de forma que auan s´apliqui el camp elèctric es desdoblarà en varies
bandes de diferent pes molecular. Si es coneix la situació concreta de 1
proteïna, es poden comparar. És important sobretot per estudiar patologies.
DETECCIÓ DE
PROTEÏNES
Seveix per
detectar el nivell de proteïnes d´una població concreta. Si es vol saber
exactament quantes proteïnes d´un tipus hi ha. Normalment s´anomena Western
Blot. Té vàries passes:
-
Es fabriquen a quin animal?
-
A quin teixit?
-
Semblant?
-
És activa?
Es tritura un
teixit, es fa una electroforesi de poliacrilamida en presència de SPS.
Apareixeran una sèrie de bandes amb proteïnes.
S´agafa 1
animal i se l´injecta, però provoca anticossos contra les molècules injectades.
S´han de
transferir el gen de poliacrilamida a fulles de nitrocel·lulosa mitjançant un
camp elèctric. Són molt reactives.
S´afegeixen els
anticossos i si troben una molècula que s´assembli a la molècula injectada,
s´enganxarà. Quan es buidi el contingut, s´afegeix proteïna G que té molta
afinitat pels anticossos. Està marcada amb I125 radiactivament i
buscarà els anticossos per unir-se.
Si troba
anticossos s´enganxarà a ells i, per detectar la radiactivitat, es col·loca a
una caixa de radiografia a les fosques durant 1 dia. La radiografia és
totalment transparent escepte on hi ha hagut proteïnes, que seran similars a les bandes de proteïnes
(tques negres). Després es poden comparar mitjançant electroforesi les
semblances en els tamanys. La tinció mitjançant nitrat de plata és per
augmentar la sensibilitat de la quantitat de proteïna, que és molt petita.
Inicio.
 |
