TÈCNIQUES
ESPECTREFOTOMÈTRIQUES
Les tècniques
espectrofotomètriwues permeten mesura la quantitat d´un producte en una
solució.
APARELL
L´aparell que
s´utilitza és una bombeta de Tungsten que emet llum visible entre 300 i 700 nm.
També s´utilitza una bombeta de Deuteri que emet raigs ultraviolats no
visibles.
La llum passsa
per un filtre que només deixa passar la llum de 340 nm. Aquesta llum passa per
la cubeta on es col·loca la mostra que es vol calcular. Al final hi ha un
detector de llum.
L´espectrofotòmetre
emet una intensita de llum i la mostra ens absorbirà llum en funció de la
concentració. Mesuren la absorbància d´una mostra. Aquests valors d´absorbància
no tenen cap unitat.
CÀLCUL
A) Utilitzant
la llei de Lambert-Beer:
A = a.b.c
Absorvància =
coeficient d´extinció molar.pas de llum.concentració de producte
El
pas de llum és la distància que ha de recòrrer la llum per atravessar la
mostra. Aquesta distància és d´1 cm. Permet que c = A/a.
El
coeficient d´extinció molar és un valor empíric que depén de cada substància i
del PH i que es troba a les taules. S´ha de fer servir una recta patró.
B) Recta patró:
Al
no tenir el coeficient d´extinció molar, s´agafa glucosa i es fa una
concentració de 1 mgr/ml, 5mgr/ml i 10 mgr/ml i es dóna la recta patró.
El
valor d´absorbància és calculable també mitjançant 2 mètodes.
QÜESTIONS
RELACIONADES AMB LA LONGITUD D´ONA (l)
· Cada
substància té un espectre d´absorció determinat. Donarà un patró d´absorció
determinat perquè les molècules absorbeixen una longitud d´ona determinada. Les
substàncies s´han de mesurar al punt on l´absorvància (longitud d´ona) és
màxima.
· Només s´han de
mesurar substàncies pures: una mostra té molts elements que absorbeixen llum,
per això s´ha d´eliminar tota la resta de partícules que no volem mitjançant la
centrifugació (on queda un sediment (cèl·lules precipitades) i un sobrenedant
(sèrum). A la bioquímica clínica s´utilitza sempre el sèrum. A qualsevol
longitud d´ona hi ha absorvància perquè hi ha una barreja de molts components al
sèrum. Es fa mitjançant reaccions prèvies. El reactiu ha de ser específic i ha
de fer que canviï la seva estructura molecular
i que passi de ser transparent a tenir color (dobles enllaços, canvis
d´estructura...). Per eliminar qualsevol infestació, a clínica, es fa una prova
en blanc (es dóna un valor d´absorvància que s´ha de restar al sèrum més reactiu). Aquest valor
d´absorbància s´ha de calcular i es fa mitjançant la llei de Lambert-Beer o la
recta patró. El coeficient d´extensió és el del reacitu. Per fer la recta patró
s´ha d´afegir al serum per poder-la calcular.
PROBLEMES
1. El PH de la
substància varia el coeficient d´extinció.
2. La temperatura
no varia el coeficient d´extinció molar (a les substàncies pures). Quan per
mesurar s´ha d´afegir reactiu, depén de la temperatura.
3. El límit de
detecció de l´aparell: els espectrofotòmetres tenen un límit. El límit de
detecció es sitúa a 2´000. Si ens trobem al límit, s´ha de diluir la prova fins
que quedi entre el 0 i el 2 d´absorvància. Després s´ha de multiplicar pel
factor de dilució.
El límit dels patrons: potser el valor que tenim queda fora de la
recta patró. Es soluciona calculant la recta mitjançant més punts o diluint la
mostra a la meitat.
TIPUS
D´ESPECTROFOTOMETRIA
En funció del
tipus de làmpara que utilitzem, tindrem diferents tipus d´espectrofotometria.
Si utilitzem
raigs X, es col·loca una placa fotogràfica que farà que s´absorbeixi més o
menys llum.
Si es tracta
d´una làmpara de Deuteri, de llum U.V., serveix per controlar concentracions de
proteïnes, DNA... perquè absorbeixen els raigs U.V.
L´espectrofotometria
visible és la més utilitzada a clínica. Funciona amb la làmpara de Tungstè i
emet llum visible.
Si es tracta de
raigs I.R., no té una aplicació clínica directa. Permet valorar l´estructura
atòmica dels elements.
Les microones,
els TAC, les ecografies... són molt semblants als raigs X ( ) i les microones ( ). Als raigs X només
els aturarà les sustàncies denses. A les microones, els teixits, fluids....
dispersen els raigs i permeten donar una imatge.
L´espectrofotometria
de fluorescència podria ser visible, però es té una làmpara U.V. i si la mostra
té substàncies de llum fluorescent, l´emeten. A certes infeccions es fa aquesta
tècnica.
També hi ha el COBAS
BIO.
Hi ha
espectrofotòmetres de química seca perquè s´agafa una mostra del pacient i es
diposita a les tires adhesives quadrades i hi ha reactius que donen color quan
es barregen. Mesuren la reflectància de la mostra. Tenen com a avantatge que es
pot treballar amb sang directament. Són molt fàcils de fer servir.
L´espectrofotometria
de flama mesura l´espectre de llum que dóna una substància quan és cremada.
Es pot valorar per mesurar ions.
Inicio.
 |
