TÉCNICAS DE CLONACIÓN

La clonación consiste en crear individuos iguales genéticamente. Pero no tienen por qué ser iguales fenotípicamente ya que el ambiente influye mucho.

DIVISIÓN ARTIFICIAL DE EMBRIONES

En el estadio de mórula se puede dividir el embrión en 2 embriones.

1-Disociación de blastómeras à separar a célula cuando el embrión es joven (2,4 u 8 células).

2-Bisección embrionaria de mórula o blastocisto.

DISOCIACIÓN DE BLASTÓMERAS

Podemos separa las células totipotenciales (antes de la activación del genoma) à tendremos individuos clónicos.

Primero hay que eliminar la membrana pelúcida.

Después retirar la célula à medio en el que no haya ni calcio, ni proteína ni magnesio à la célula se separa:

        -Embrión de 4 células à obtención de 4 individuos.

-Embrión de 8 células à las blastómeras ya tienen una historia à el reloj biológico no se reprograma. Los blastocistos que se formen serán pequeños à dificulta más la implantación (pero si son totipotenciales).

Si se hace una división del embrión de 8 células, funciona mejor hacer 2 embriones de 4 células o 4 embriones de 2 células.

Para la transferencia de los embriones se vuelve a colocar la zona pelúcida.

Estos embriones estarían en el oviducto à sin zona pelúcida se puede provocar:

·        Gestaciones ectópicas en el oviducto.

·        Respuesta inmunitaria en el oviducto por parte de la madre (no en el útero à no haría falta la zona pelúcida).

·        Necesaria para la compactación de la mórula.

Estas zonas pelúcidas vienen de donantes.

Los factores que afectan son:

q       Pérdida de zona pelúcida.

q       Pérdida de contacto entre las blastómeras à puede ser perjudicial.

q       Al no reprogramarse à tamaño reducido del blastocisto por el bajo número de células.

Actualmente es una forma poco utilizada porque estos embriones se encuentran en el oviducto à necesaria la intervención quirúrgica del donante.

BISECCIÓN EMBRIONARIA

Puede se de mórula o blastocisto. En el blastocisto tenemos que cortar por la mitad de la masa celular interna. Cada medio embrión se llama demiembrión o hemiembrión.

Sólo hace falta un medio sin proteína (los embriones se enganchan en el fondo de la placa). Se añade sacarosa para hacer un medio hiperosmótico à el embrión pierde agua à se colapsa y es más fácil cortar. Se corta con una cuchilla.

Las posibilidades del éxito dependen de:

q       Transferencia del embrión entero à 60% de gestación.

q       Transferencia de hemiembrión à 45-50% de gestación. Pero si se suman los dos, como mínimo conseguiremos un embrión. Por lo tanto, podemos mejorar la tasa de gestación. Además, en la especie bovina, al ser los dos individuos del mismo sexo à no hay free-martinismo.

Lo que también se puede hacer es:

-Implantar un embrión.

-Congelar el otro embrión à para esperar el valor biológico del otro hemiembrión.

Se puede hacer el sexaje con células que quedan libres en el medio a la hora de la bisección à sexaje por PCR.

Cuando se congelan los hemiembriones, se disminuye la tasa de gestación al 20%.

Como la mórula y el blastocisto ya están en el útero, no se requiere la zona pelúcida.

Este método es el más usado.

TRANSFERENCIA DE NÚCLEOS

Se usa:

-Karyoplast à núcleo donante.

-Cytoplast à citoplasma receptor.

Se pensaba que sólo se podía hacer:

-Karyoplast à debía ser una célula totipotente.

-Cytoplast à oocito de metafase II.

Ya se había conseguido en los años ’80.

La obtención del Karyoplast:

-Puede ser sólo un núcleo.

-Toda una célula pero que tenga poco citoplasma.

La enucleación del cytoplast:

El Cytoplast debe tener mucho citoplasma, se suele usar microscopía de fluorescencia para eliminar la placa metafásica para enuclear. Hay especies en las que se ve bien.

Se inyecta el Karyoplast en el espacio perivitelino.

Se produce una descarga eléctrica que provoca fusión de las membranas y  activación partenogénica del Cytoplast.

La descarga eléctrica simula la entrada del espermatozoide.

La activación del Cytoplast también permite la reprogramación del Karyoplast à pérdida de la memoria.

Actúa como célula embrionaria una célula.

La causa de la reprogramación son factores que se encuentran en el citoplasma de los ovocitos en metafase II y, actualmente, son desconocidos. La utilización de ovocitos en otras fases disminuye el porcentaje de reprogramación.

Obtención de los Karyoplast

q       A partir de blastómeras de embriones preimplantacionales (2, 4 , 6, 8 células y mórulas).

q       A partir de blastocistos à células de la masa celular interna. Además, las podemos ir cultivando y que se vayan multiplicando. Son las Stem Cells. Son células genéticamente iguales.

q       A partir de la líneas de células somáticas de feto (células ya diferenciadas). Estas células también se pueden cultivar de forma indefinida.

q       A partir de células somáticas de animales adultos (oveja Dolly à glándula mamaria).

q       También se puede hacer de células a partir de biopsia de cualquier tejido à obtención y cultivo de células.

q       Hace poco se ha demostrado que se pueden reutilizar los embriones clonados otra vez como Karyoplast à esto permite hacer ciclos indefinidos de un mismo individuo clonado.

DOLLY

Se ha visto que debe haber una misma actividad nuclear entre el Karyoplast y el Cytoplast. El oocito en metafase II tiene un estado letárgico y pasa a quiescente.

Las células del Karyoplast debían estar en la fase G0 à quiescente. Es fácil de conseguir à disminuir del 10% del suero habitual al 5% y no tendrá nutrientes y se parará su actividad.

Sábado, 6 Abril, 2002 0:01

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