CRIOCONSERVACIÓN
Es la técnica más utilizada en la granja. Aunque se pensaba que sería un gran avance en la reproducción, no ha acabado de suponer un éxito, ni mucho menos resulta tan importante como la inseminación artificial.
La crioconservación está asociada a otras especies: superovulación, recuperar embriones, crioconservación y dar los embriones. El éxito sería tener la capacidad de poder sexar los embriones.
La crioconservación es la técnica de conservación de material genético que se aplica manteniendo los embriones a menos de –130 ºC à punto donde el material embrionario queda parado. Deberá ser reversible y que se mantenga la integridad celular.
La finalidad es la de separar en el tiempo la obtención de los embriones y su transferencia à mantenimiento indefinido. Se dice que su viabilidad sólo se afecta por las radiaciones ambientales y, por lo tanto, se piensa que puede aguantar sin problemas durante siglos.
El cultivo in vitro o in vivo no para el material embrionario y, por lo tanto, no permite el mantenimiento indefinido.
La refrigeración entre 0 y 4 ºC permite mantener los embriones unas horas.
El primer nacimiento se hizo en el 1972 en ratón. A partir de ahí, se han hecho en otras especies. En el cerdo se hace en el 1989 porque es una especie difícil, ya que es sensible a baja temperatura.
No es una técnica todavía efectiva del todo. Funciona muy bien en rumiantes à viabilidad de embrión crioconservado es muy parecido a la del embrión fresco (50-60%). Pero no es siempre como el cerdo.
Como más joven es el embrión, más difícil es que supere la crioconservación y, por lo tanto, más frecuentemente blastocisto. La excepción se da en ratón y conejo, ya que todos los estadios son resistentes a crioconservación.
En la granja se recupera unos 4 embriones de media (se puede, en condiciones muy buenas, recoger hasta 6 embriones).
Ahora, en el 1999, también se recogen 4 embriones por hembras donante. Se aumenta el número de embriones transferidos, pero se aumenta mucho la crioconservación.
La crioconservación está limitada por el éxito de la superovulación y recuperación del embrión (si no se hacen no tenemos embriones para crioconservación).
APLICACIONES Y VENTAJAS DE LA CRIOCONSERVACIÓN EMBRIONARIA
MANEJO
La recuperación de embriones es muy variable. La sincronización es un proceso que cuesta dinero en fresco porque no se sabe el número de embriones que se tendrán.
La crioconservación permite preparar las receptoras concretas, permite hacer transferencias seriadas y partos de forma progresiva. Se aprovechan los ciclos naturales después de 6 días de la ovulación. También se puede predeterminar el parto porque al ganadero le conviene por diferentes motivos.
Puede hacer que se predetermine las hembras que se usan para parir y las que se usan como madres adoptivas.
IMPORTACIÓN / EXPORTACIÓN DE MATERIAL GENÉTICO
Los problemas de aduana son mínimos porque siempre han sido estériles y tienen tripsina en sus primeros medios que hace que se eliminen los microorganismos. Está regulado por el BOE.
La zona pelúcida siempre se debe mantener entera para evitar que los microorganismos contacten con las células embrionarias.
Los problemas legales son muy bajos.
La crioconservación permite una selección genética más intensa. Se usa una madre que se superovula y se potencia la selección vía paterna y materna con el semen y oocitos.
BANCOS DE EMBRIONES
Tienen importancia genética. Se intentan hacer en animales en peligro de extinción para mantener la diversidad genética. No se puede perder las razas autóctonas. También se usa como un control delos métodos de selección genética. Se aplica una línea de selección genética.
Es un seguro biológico por si aparece una epidemia que acaba con alguna raza concreta.
CLONACIÓN Y SEXAJE
Junto a la crioconservación tiene una gran selección. Sirve para poder transferir lo que nos interese.
INVESTIGACIÓN Y CRIOBIOLOGÍA
Dividiendo una mórula se tiene dos individuos iguales que permiten estudiarlo. Además, sirve para estudiar como crioconservar los órganos.
INCONVENIENTES O DESVENTAJAS
Asociados a la superovulación de embriones y transferencia de embriones porque hay una variabilidad muy grande a la respuesta superovulatoria.
Siempre que las condiciones de manejo no son idóneas, se conduce al fracaso. Sólo en aquellas explotaciones donde el manejo es correcto.
Hay mucha variabilidad de los animales en el número de embriones. No se debe diseñar erróneamente una explotación que tenga la misma genética porque puede eliminarse fácilmente.
Los costes son elevados. El coste inicial es caro, pero el mantenimiento no.
La variabilidad de resultados es muy alta. Hay muchas explotaciones en los que estos resultados no son muy buenos.
REACCIÓN DEL EMBRIÓN A BAJAS TEMPERATURAS
La ciencia que lo estudia es la criobiología (procesos a bajas temperaturas). Los embriones están formados por más de un 80% por agua. El propio embrión es una solución acuosa disuelta en esta agua de las células.
Separada de otra solución acuosa extracelular por una membrana celular parcialmente permeable. Cuando se pone en medio líquido hay una reacción entre una solución acuosa intra y extracelular. Si el ambiente extracelular es hiperosmótico, el embrión perderá agua. Los embriones tienen capacidad de responder osmóticamente.
Si se pone un medio hiperosmótico, se deshidrata porque sale agua a compensar la solución acuosa. Se puede decir que el embrión tiene unas propiedades coligativas (tiene una presión osmótica determinada aproximada de 300 mOsm), como es agua más solutos, tiene un punto de congelación (temperatura a partir de la cual congela), punto eutéctico (temperatura a la que pasa de ser líquido a sólido de forma progresiva).
Comienza a congelarse a –7ºC pero no se vuelve sólido hasta –20ºC. La más importante es la capacidad de respuesta osmótica. También se debe entender que entre el ambiente intracelular y extracelular hay un transporte de agua y de calor o frío (siempre del ambiente extracelular hacia el intracelular).
El destino del agua intracelular de un embrión à si todo el agua congela, morirá. Se debe conseguir que el embrión se deshidrate para evitar que se congele dentro del embrión. Está afectado por otros factores.
Evitando que el 40% del agua se congele, es suficiente. Si se consigue una pérdida de agua total, también lo mataríamos. Tampoco se debe hacer de golpe, porque también lo mata. No se puede hacer una deshidratación brusca o directa. Debe ser gradualmente. Se consigue gracias a la capacidad de respuesta osmótica del embrión y bajando la temperatura de forma progresiva para que pierda agua intracelular lentamente. Cuando se disminuye la temperatura acuosa, primero congela el ambiente extracelular. Si un ambiente se congela, forma cristales de hielo. El resto del agua está hiperosmótica e incrementa la presión osmótica del ambiente extracelular. Provoca que el ambiente extracelular esté hiperosmótico y el embrión pierde agua según si es brusco o progresivo. Si se hace progresivamente, hay un equilibrio entre la temperatura y la pérdida de agua. Cada vez se irá perdiendo más agua. Los cristales buscan núcleos para perderse. Con el ambiente intracelular y extracelular pasa igual. El ambiente extracelular cada vez queda más hiperosmótico.
Parando el enfriamiento hasta –80ºC, habría suficiente porque se habría perdido la mayoría del agua del embrión. Debe ser lento. Se hace disminuyendo la temperatura 0’2 ºC / minuto. Así se asegura que pueda responder osmóticamente perdiendo agua. Así, la viabilidad es máxima. Si los cristales de hielo son muy grandes, la supervivencia es leve.
Cada tipo celular tiene una tasa de enfriamiento óptima. Son células muy grandes. A mayor es la célula, más alta es la tasa de enfriamiento que se debe aplicar. En eritrocitos se puede llegar hasta los 1000ºC / minuto de congelación porque su tamaño es pequeño y tiene muy poca cantidad de agua total.
Un linfocito tiene un óptimo de 10 ºC / minuto.
La tasa de enfriamiento está en función del tamaño.
Las causas que pueden provocar su muerte son:
-Formar mucho hielo intracelular. Sobretodo importante porque tiene una tasa de congelación demasiado rápida. No hay equilibrio entre la pérdida de temperatura y equilibrio osmótico.
Tampoco se debe aplicar una tasa de congelación muy baja para evitar que se deshidrate totalmente. Si pierde toda el agua, da deshidratación, llega a un volumen de no retorno y no puede recuperar su volumen inicial. El ambiente extracelular cada vez será más hiperosmótico y puede llegar a ser tóxica para el embrión.
-Planos de fractura de los cristales de hielo que son cortantes. Si el cristal crece cerca del embrión, puede romper el embrión. No se puede transferir ningún embrión sin la zona pelúcida íntegra.
ETAPAS DEL PROCESO DE CRIOCONSERVACIÓN
Hay 6 etapas:
· Embriones deben perder agua progresivamente. Además, también deben contactar con sustancias crioprotectoras. Protegen estabilizando la membrana (Dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol). Además, también bajan el punto de congelación del embrión.
· Enfriar el embrión asegurándote que el medio extracelular congela de forma segura à inducción de cristalización extracelular añadiendo cristales de hielo a –5/-7ºC.
· Enfriar el embrión de forma lenta y progresiva a –0’2ºC / minuto a –0’5 ºC / minuto con aparatos caros hasta –40 ºC. Puede durar hasta 3 horas. Tienen una capacidad limitada. En bovino, sólo un embrión / pajita.
· Se almacena a –196 ºC en N2 líquido de forma indefinida. La temperatura de la fase líquida es económica para tener bajas temperaturas porque es una forma fácil de tenerla.
· Se debe descongelar cuando se quiere usar. La tasa de descongelación depende mucho de la temperatura a la que se parado el enfriamiento. Si se para a –80 ºC, la descongelación debe ser lenta para que pueda recuperar su volumen de forma lenta y progresiva. Si se para a –40ºC, se sabe que hay muy pocos cristales pequeños intracelulares que no matan el embrión y se debe aplicar una descongelación rápida para que crezca por nucleación y evitar que puedan crecer los cristales dentro del embrión.
· Se debe eliminar el crioprotector dentro del embrión. Hoy día se están descubriendo procedimientos que rompen con el enfriamiento lento y progresivo. El método convencional es de equilibrio. Los métodos de no equilibrio o vitrificación exponen los embriones a unas concentraciones de solutos tan altas que cuando se disminuye la temperatura, la viscosidad es tan grande que no cuenta, sino que vitrifica hasta que queda sólido sin cristalizar à las moléculas quedan paradas sin cristalizar.
Los cristales tienen las moléculas organizadas y no son transparentes. Se consigue una solidificación sin formar cristales. Permiten una alta viabilidad, incluso para embriones muy sensibles a la manipulación.
Permite pasar de temperatura ambiente a N2 líquido. Es un proceso muy rápido. La viabilidad más o menos es igual que la convencional.
La solución puede llegar a ser tóxica.
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