CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES
CULTIVO IN VITRO LARGO
La finalidad es conseguir un cultivo in vitro.
El ambiente para mantenerlo es del 5% de CO2 (el más habitual) o del 5% de CO2 + el 5% de O2. Hay que bajar la concentración de O2 porque el embrión es rico en lípidos y podríamos tener oxidaciones no deseadas, por eso se añade una concentración de N2 al 90%.
Los medios de cultivo generalmente son comerciales, pero están formulados para el crecimiento celular y, por lo tanto, hace falta modificarlo:
-H2O + sales à el agua siempre de gran calidad y las sales hacen que la osmolaridad sea de 270-300 mOsm (igual que el embrión).
-Tampón bicarbonato.
-Fuentes de energía:
· Glucosa o glutamina para embriones de estadios avanzados. Normalmente se combinan las dos.
· Piruvato y lactato para los estadios iniciales.
· Aminoácidos y ácidos grasos en todos los estadios.
· Factores de crecimiento (EGF, ILGF), vitaminas (el conejo las necesita).
· Suero o albúmina sérica bovina. El suero actúa como disolvente y presenta muchas sustancias que actúan de forma embriotrófica à no se sabe que sustancia tienen cada componente,
· GFB.
· FCS.
La albúmina sérica bovina puede sustituir la BCS, el cual está más definido.
El que tiene FCS y BSA presenta macromoléculas que hacen que los embriones no caigan en el fondo de la placa.
La adición de células se haría en un cultivo para mejorar el crecimiento: son células oviductales, fibroblastos y renales. Se hace que queden en la base de la placa y, así el embrión tiene cierto contacto con ellas.
De forma global se dice que un embrión cultivado:
-Tiene menos células.
-Tiene menor tamaño.
-Desarrollo más lento.
El embrión in vitro tiene menos capacidad de implantación. Como más largo es el cultivo, tienen menos posibilidades de implantarse porque disminuye el número relativo respecto in vivo à mortalidad embrionaria marcada.
La pérdida de viabilidad se da por:
-Temperatura in vivo es constante, pero in vitro hay oscilaciones por nuestra manipulación.
-La luz à in vio está en la oscuridad, pero in vitro, al mirarlo en la lupa, hay mucha intensidad de luz que produce una oxidación de las grasas.
-Intercambio de nutrientes y catabolitos à in vivo la aportación y retirada de sustancias es continua. In vitro sólo les aportamos en determinados momentos y, por lo tanto, disminuye la concentración de nutrientes e incrementa los metabolitos.
Hay un bloqueo del desarrollo embrionario en determinadas especies à tienen un bloqueo del desarrollo. Tiene lugar en el momento en el que se debe activar el genoma embrionario à en rumiantes en el estadio de 8-16 células. Quiere decir que el sistema de cultivo es subóptimo, en el momento de muchos requisitos, el embrión no los tiene. El cocultivo celular ha solucionado bastante el problema.
SÍNDROME DE FETOS GRANDES Y GESTACIÓN ANORMALES LARGAS
Se trata de un síndrome en los embriones que dan fetos grandes y se aumentan los días de la gestación à cesáreas. Se dan especialmente en rumiantes.
Se piensa que se debe al suero en el medio del cultivo. Aparte, suelen dar anormalidades o malformaciones congénitas à puede sugerir un daño durante el cultivo en las células de la masa celular interna.
Por lo tanto, a técnica no es demasiado fina y hay que hacer modificaciones.
En EE no ha nacido ninguno.
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