PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES
MADURACIÓN DEL OOCITO “IN VITRO”
“IN VIVO”
Se producen cambios fisiológicos durante la fase preovulatoria (horas antes).
Se capacitan para ser fecundados y desarrollarse hasta embrión hasta la implantación.
Está provocada por un pico de LH.
Se producen cambios nucleares, citoplasmáticos (incrementa la síntesis de proteínas, reorganización), zona pelúcida (maduración de ZP1, ZP2 y ZP3 (la más importante para reconocer el espermatozoide, evitar la poliespermia y la reacción acrosómica)) y en la las células foliculares (deben crecer).
La meiosis produce la primera división de cromosomas y la segunda división de cromátidas. Hay cuatro fases:
-Profase.
-Metafase.
-Anafase.
-Telofase.
Se pasa de 2n4c en la primera división y se queda en fase de profase (todos los oocitos en el nacimiento se encuentran en esta fase).
En la pubertad, la FSH estimulará varios folículos. En algún momento hay un pico de LH preovulatorio.
En ese momento se da un reinicio de la meiosis parada: Metafase I, anafase I, telofase I y da el primer corpúsculo polar (n2c). Después al n2c que nos queda nos dará una segunda división meiótica en la que se da la profase II, metafase II. En este estadio se para y es cuando se produce la ovulación. Esto es lo que se debe conseguir en la maduración “in vitro” cogiendo oocitos en la profase I.
Se volverá a reactivar con la fecundación espermática y se hará la eliminación del segundo corpúsculo polar.
“IN VITRO”
Conseguir que el oocito siga los mismos cambios que el oocito in vivo: pico de LH, ambiente adecuado, etc.
Tipos:
· Maduración intrafolicular à oocito dentro del folículo y se pone a cultivar à no funciona..
· Maduración extrafolicular à es lo que hace. El oocito se encuentra fuera de los folículos.
Hay criterios para seleccionar la fuente y el tipo de oocito.
ORIGEN DE LOS OOCITOS
· Recogida de hembras vivas à es la mejor, podemos saber el estado hormonal, nutricional... de la hembra:
o Vía endoscópica (aspiración) o vía vaginal (ecografía y aspiración con aguja fina).
o Como ventajas, se puede repetir el proceso en las hembras.
o Se hace en hembras de elevado valor genético, en hembras prepúberas, viejas o gestantes.
o Aplicación comercial.
· Recogida del matadero à es la fuente más utilizada en los laboratorios. Obtención de los ovarios (poner en solución salina en caliente (37ºC)).
o Como ventaja tiene un elevado número de oocitos a bajo precio (no utiliza este órgano). En hembras vivas sí es caro.
o Como inconveniente no se conocen nada de la hembra (estadios hormonales, sanitarios...).
· Recogida de hembras ovarioectomizadas:
o Se cogen hembras, se hace una estimulación y se hace una eliminación del ovario.
o Como ventaja se conoce el estado fisiológico, los oocitos son de elevado precio, no hay repetición de la hembra.
TÉCNICAS DE RECOGIDA DE LOS OOCITOS
DISECCIÓN
Se cogen ovarios, se recortan, se abren y se recogen los oocitos. Tiene un elevado rendimiento del 90-100%. La máxima integridad de las células del cúmulus. Es importante para la maduración del oocito. Las células del cúmulus están unidas al oocito que le permiten la nutrición.
Como inconveniente necesitan mucho tiempo para obtener pocos oocitos.
ASPIRACIÓN
Es la más utilizada actualmente en vaca y cerda. Hay que coger una jeringa con diferentes agujas y se coloca dentro del folículo y se aspira para hacer presión negativa.
Es una forma más rápida. El rendimiento es medio del 50-75% y tiene menor calidad del cúmulus porque hemos aspirado y arrancado el oocito.
TÉCNICAS DE RECOGIDA EN MASA
Es mucho más rápida. Se hace un “slicing” y se corta el ovario con el bisturí. Se obtienen muchos oocitos.
Como inconvenientes, hay mucha diversidad de folículos (oocitos de grande y pequeño tamaño, atrofiados...) Se deberá hacer una selección de los oocitos adecuados.
A partir de la entrada al laboratorio todo debe estar en esterilidad. Antes de entrar en el laboratorio, hay que limpiar bien con desinfectante y antibióticos los ovarios. A partir de aquí, se hace con la máxima esterilidad.
SISTEMAS
DE MADURACIÓN IN VITRO (MIV)
Se hace en hembras prepúberas (animales nacidas vivos) y animales púberas.
Los medios de cultivo que se usan son:
· Solución salina en medios complejos à TCM199 (sales, azúcares, vitaminas, hidratos de carbono...). Es el más utilizado.
· Suplementos:
o Fuente de macromoléculas: normalmente suero fetal bovino, suero de hembras en celo, albúmina sérica bovina, fluido folicular de folículos no atrésicos (es el ideal porque tiene todo lo necesario).
o Hormonas:
§ FSH à estimula el desarrollo de las células del cúmulus.
§ LH à maduración del oocito.
§ Estrógenos à favorecen la aparición de resistencias a la FSH de las células del cúmulus.
§ Progesterona (en perra) ayuda a la maduración.
§ Insulina (cerdo).
§ Factores de crecimiento à ya están dentro del fluido folicular.
·
Insulin
Like Growth Factor.
·
Epidermal
Growth Factor.
SISTEMAS DE COCULTIVO
· Microgotas à 1 gota (100 ml) en medio de una placa de Petri. Colocan 8-10 oocitos por gota. Se cubren las gotas con aceite mineral para evitar la evaporación. Es el sistema más utilizado y más limpio.
· Placas de Petri à 2 ml + 50 oocitos (No hace falta aceite mineral). Las células cambian el chip y, en vez de sintetizar estrógenos dan progesterona. Para evitar esto, deben estar en constante agitación dentro de la incubadora.
CONDICIONES DE CULTIVO
Dentro de una incubadora.
La temperatura corporal es de 38’5-39 ºC.
La atmósfera es de 5% de CO2.
El tiempo depende de la especie. En vaca es de 24 h, en cabra es de 27 h y en cerdas 42-44 h.
VALORACIÓN DE LA MIV
Primero hay que mirar si hay expansión del cúmulus à a veces en la maduración in vitro si se puede producir la maduración pero no la expresión.
Segundo si ha extrusionado el primer corpúsculo polar, el 50% desparece.
Estos dos tipos no nos sirven:
· Maduración nuclear à tinción LACMOID. Si está en profase I no hay maduración. Si está en metafase II, sí hay maduración. Como inconveniente, nos cargamos el oocito. Puede servir para coger el oocito de una muestra. No implica que haya maduración citoplasmática, etc.
· Maduración citoplasmática à cambios ultraestructurales. Necesitan ME. Es poco práctico. No nos asegura la síntesis de proteína esencial.
· Capacidad de desarrollo del oocito después de la fecundación: no hay una descondensación de ningún espermatozoide (no sirve). Producción de mórula, blastocisto (una vez fecundados nos indica si ha habido maduración, pero hay una viabilidad inferior que in vivo).
· Nacimiento de un animal vivo à selección de los mejores embriones. Hacemos un error. Hay pocos nacidos.
PREPARACIÓN DEL ESPERMATOZOIDE PARA LA ICSI
(INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DEL ESPERMATOZOIDE)
El ICSI , cuando los espermatozoides son recién eyaculados, no son capaces de fecundar. El espermatozoide se prepara morfológicamente y bioquímicamente mientras pasa todo el tránsito femenino que hace que cuando llegue al oviducto, esté preparado para fecundar. Se hace in vitro la capacitación.
Salen 12 millones de espermatozoides por eyaculado.
En cerdo hay 15000 millones de espermatozoides por eyaculado porque es mucho el semen que eyacula.
El número de espermatozoides depende de los gramos de testículo. Una forma de selección de los sementales es pesando los testículos.
Cuando los espermatozoides salen por el epidídimo, se van preparando con capas en la cabeza que les hace ser muy estables y que están muy independientes del medio ambiente. A más largo es el paso por el epidídimo, en la eyaculación está más protegido. Para que pueda fecundar debe desprotegerse.
Por eso también hay que saber que el tiempo que necesita para hacer el tránsito por todo el epidídimo. A menor tránsito, es más fácil la fecundación in vitro porque es más fácil eliminar esas cubiertas.
En humano tiene un intervalo de 1-12 horas. En humanos se coge el eyaculado y se pone en medio salino y se produce capacitación muy rápida. En animales tarda mucho más porque es mucho más estable.
En general son más estables de lo que se considera para humano. El número de espermatozoides que llegan al ovocito en condiciones normales de la hembra. A la vagina llegan 6000 ó 4000 millones.
Finalmente, llegan por cada óvulo:
Rata 0-20, ratón 1-12, hámster 50, conejo 1-10, vaca 10, oveja 15 y cerda 130.
El proceso de selección es muy elevado.
In vitro se necesitan muy pocos espermatozoides / ovocito en la placa de Petri. La capacitación in vitro del espermatozoide es preparar todo el proceso que tiene el espermatozoide al atravesar el aparato genital femenino. Esta capacitación se ve en el laboratorio cuando al coger los óvulos de la hembra y los espermatozoides no fecundaban.
La capacitación consiste en cambios del espermatozoide en el tracto genital femenino que le hacen capaz de fecundar ovocitos. Dotan al espermatozoide de la reacción acrosómica (cambio estructural de la cabeza del espermatozoide) y de exhibir la hiperactivación (cambio morfológico debido a cambios moleculares del espermatozoide). Son cambios de la membrana plasmática.
La fecundación es la unión de la membrana plasmática del ovocito con la membrana plasmática del espermatozoide. Se debe eliminar la capa externa del espermatozoide para permitir que los enzimas digieran la zona pelúcida del ovocito para permitir que la membrana plasmática del espermatozoide contacte con el ovocito. Mientras están intactos, no se pueden unir.
Los cambios bioquímicos de la capacitación son cambios de membrana que se desestabilizan de forma que lo que se busca es una desestabilización que permite exponer la membrana plasmática del espermatozoide al ovocito. Toda la membrana del acrosoma está recubierta por capas protectoras. Es muy estable como más recubierta está.
Si se eliminan las membranas y no hay ovocito, se muere el espermatozoide.
La reacción acrosómica espontánea se produce cuando muere el espermatozoide y se desestabiliza la cabeza.
La cola del espermatozoide, cuando están en un medio de cultivo normal, tiene un movimiento ondulante muy claro. Cuando se produce la capacitación in vitro, hay cambios en la cola que hacen que se muevan muy fuerte e indica que está en capacitación.
En condiciones normales es tan fuerte este movimiento porque en la fecundación in vivo debe desprenderse del epitelio del oviducto.
Cuando llegan al óvulo, como están fijados al epitelio del oviducto, empiezan las reacciones bioquímicas de la capacitación y cuando se capacitan bien, se desprenden de las células del oviducto.
En general, hay cambios en la membrana plasmática en la capacitación:
§ Composición y distribución de fosfolípidos.
§ Disminución de la carga negativa de la superficie.
§ Eflujo del colesterol que hace las membranas permeables.
§ Eliminación y/o alteración de las glucoproteínas periféricas.
§ Reordenación entre las proteínas integrales.
También hay cambios en los iones intracelulares (los espermatozoides necesitan que para capacitarse, tengan mucho calcio dentro) y cambios en el sistema adenilato-ciclasa / proteína kinasa.
También hay cambios en el metabolismo y en el núcleo y acrosoma.
El tiempo de capacitación depende de la especie (según el tránsito del espermatozoide en el epidídimo). Según la raza o línea, para la misma raza, hay veces que se capacitan muy rápidamente y otras veces no es fácil capacitarlos.
El estado hormonal de la hembra también influye porque en condiciones normales, las hembras deben estar en celo. Si artificialmente se pone sin estar en celo, no tiene lugar la gestación. Cuando la hembra está en celo tiene todas las hormonas reproductivas que hacen que la capacitación sea muy rápida. El tipo de secreciones hace que la capacitación sea más rápida.
A más tránsito epididimario, más difícil.
En condiciones normales, la capacitación se da en el istmo del oviducto. Está entre el cuerno y el oviducto.
Los factores capacitantes existentes en los fluidos de la hembra son:
§ Glicosaminoglicanos (Heparina). Es muy rápida y mueren muchos.
§ Aceptores del colesterol: albúmina, lipoproteínas... Desestabilizan la membrana del espermatozoide. Es más lenta.
§ Catecolaminas. Promueve la hiperactivación del espermatozoide.
§ Enzimas. Promueve la hiperactivación del espermatozoide.
§ Taurina e hipotaurina. Promueve la hiperactivación del espermatozoide.
La capacitación no es sitio-específica ni especie-específica. Se puede hacer diferentemente del tracto genital y en otras especies.
La capacitación es reversible y se puede estabilizar de nuevo al espermatozoide. Si se mete de nuevo en fluido seminal, se vuelve a estabilizar.
REACCIÓN ACROSÓMICA
Proceso que implica fusiones entre la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática, permitiendo la liberación de las enzimas acrosomales.
No desaparece la membrana acrosomal externa, sino que hace uniones con la membrana plasmática.
El significado funcional es para penetrar la zona pelúcida y para fusionarse con la membrana plasmática del ovocito.
Los agonistas naturales derivados del complejo cúmulus-ovocito activan la reacción acrosómica: Son la glicoproteína ZP3 de la zona pelúcida (reconocimiento), progesterona del cúmulus oophorus (provoca reacción acrosómica).
Se pone un influjo de calcio, que activa una fosfolipasa que activa lisofosfolípidos fusigénicos y da la fusión de membrana.
Debe haber una entrada masiva de calcio y activarán enzimas, sobretodo lipídicos para movilizar fosfolípidos de membrana.
Los espermatozoides capacitados tienen un tipo de flagelo y un movimiento muy brusco.
CAPACITACIÓN IN VITRO
En la capacitación in vivo, los espermatozoides en el tracto femenino, lo primero que hacen es liberarse del plasma seminal. Después hay que seleccionar los mejores espermatozoides y eliminan los anormales.
El plasma seminal se elimina por centrifugación que deja los espermatozoides en el fondo y se matan algunos espermatozoides. Es un sistema muy usado que, además, no diferencia entre muertos y vivos.
§ Técnica de Swim-up à se pone en un tubo de ensayo pequeño con pH , energía... para espermatozoides. Con una pipeta se coge una pequeña parte del plasma. Se coloca a 38´5 en el fondo del tubo. Los mejores nadan hacia arriba, el plasma se queda y los muertos caen abajo. A los 60-90 minutos se recoge la parte más superior del tubo donde están los mejores espermatozoides.
§ En semen con malos espermatozoides se usa el gradiente discontinuo de Percol. Son dos medios de cultivo de diferentes densidades. Se coloca el eyaculado en la superficie y se centrifuga suavemente. Al fondo van las células más densas (espermatozoides vivos). Arriba están todas las células que no interesan, espermatozoides muertos. Se usan para semen congelado. En humana se usaban para recoger los pocos normales. Actualmente está prohibido el Percol porque da toxicidad.
§ También por filtración a través de columnas: lana de vidrio, Sephadex G-15...
§ Otros métodos para mejorar la motilidad: cafeína, adenosina y análogos, taurina e hipotaurina...
§ Métodos de capacitación:
o Modificación de la osmolaridad.
o Electropermeabilización.
o Incubación en pH elevado.
o Uso de heparina.
o Uso de liposomas de fosfatidilcolina.
o Uso de fluido folicular.
o Uso de suero.
o Uso de albúmina sérica bovina.
o Uso de ionóforos de calcio.
o Uso de b-aminoácidos y catecolaminas.
o Elevados niveles de calcio.
FECUNDACIÓN IN VITRO
Cuando el espermatozoide contacta con el exterior, fuera queda la membrana acrosomal externa. El contacto de la membrana acrosomal externa e interna es específica de especie.
La penetración de la zona pelúcida es oblicua y muy rápida.
Hay varias acciones:
-Acción mecánica à movimiento hiperactivo de la cola.
-Acción enzimática à enzimas acrosómicos (hialuronidasa, acrosina) o liberados o adheridos a la membrana acrosómica interna.
La fusión de los gametos (espermatozoide + oocito) se realiza colocándose el espermatozoide de forma lateral y se fusiona por el segmento ecuatorial del espermatozoide. Es una penetración tangencial. El oocito gira dentro de la zona pelúcida.
Se fusiona el oolema con la membrana plasmática del espermatozoide y se forma una vesícula que engloba el espermatozoide y su cola. Entra todo y la cola se mantiene hasta los estadios embrionarios.
El ooplasma (citoplasma del oocito) forma una vesícula que engulle el espermatozoide y la cola. Es indispensable que el espermatozoide esté reaccionando para que el oolema (membrana plasmática del espermatozoide) se fusione con el oocito.
El oocito se activa bloqueando la poliespermia. La membrana plasmática del oocito se polariza una vez el oocito recibe la presencia del espermatozoide, el retículo endoplasmático liso libera calcio. Como consecuencia, incrementa el calcio intracelular que incrementa la permeabilidad del oocito por el potasio.
Hay un cambio de polarización del potencial de membrana que comienza donde se produce la fecundación y se extiende a toda la membrana del oocito.
Se dice que esta activación la da un factor liberado por el espermatozoide. Ese cambio de polaridad provoca un bloqueo de la poliespermia. Todos los gránulos corticales se sitúan por debajo de la membrana plasmática del oocito.
Estos gránulos corticales se liberan en el espacio perivitelino por exocitosis. Se liberan proteasas y peroxidasas. Esta fusión es la reacción cortical que da lugar a la reacción en la zona pelúcida.
Hay una modificación de la zona pelúcida en las 2 proteínas que reconocen el espermatozoide:
-ZP3 à es una glucoproteína y este enzima rompe los grupos glucídicos y no reconocerá ningún espermatozoide de la misma especie.
-ZP2 à la rompen.
Provoca un endurecimiento de la zona pelúcida (zona Hardening). Así no entra ningún otro espermatozoide.
A nivel de la membrana plasmática, hay otro bloqueo vitelino (cambios en la membrana plasmática del oocito) y no se sabe quién lo provoca.
Según la especie que sea, tiene más importancia uno u otro. Perro, oveja, hámster tienen más importancia la reacción zonal (zona pelúcida).
En rata y ratón tienen importancia las dos.
En conejo se hace un bloqueo vitelino.
CAMBIOS NUCLEARES
Cuando penetra el espermatozoide, se activa la metafase II, anafase II, telofase II y da citocinesis y da un oocito con dotación cromosómica (nc) más el segundo corpúsculo polar extrusionado en el espacio perivitelino.
El espermatozoide llega con una dotación nc.
Se forman los dos pronúcleos masculino y femenino. El pronúcleo femenino descondensa la cromatina y se pasa de división meiótica a interfase y se descondensa su cromatina.
Hay una replicación del DNA, se forma una membrana nuclear y da el pronúcleo femenino (cromatina descondensada con doble dotación).
El pronúcleo masculino se forma porque se separa la cabeza de la cola. La cola se mantiene durante mucho tiempo dentro. Se degenera la membrana nuclear, se infla la cabeza y hay una pérdida de protaminas que descondensan la cromatina. Se replica el DNA y se empaqueta en histonas y se vuelve a empaquetar. Se forma otra vez la membrana nuclear y se forma el pronúcleo masculino.
Durante la maduración citoplasmática se deben hacer proteínas y enzimas (MPGF = Male Pronuclear Growth Factor) que son indispensables para poder descondensar la cabeza del espermatozoide. Debe estar en el citoplasma de los oocitos maduros citoplasmáticamente.
La entrada del espermatozoide al oocito siempre se da en los polos opuestos dentro del oocito del corpúsculo polar. Migran los pronúcleos hacia el centro, se descondensa los cromosomas, las membranas nucleares se ondulan y se rompen. Se da durante la profase de la primera división mitótica. Se da una metafase, anafase (separa cromátidas hermanas) y telofase (separadas una en cada punta).
Se da la citocinesis (división del citoplasma de forma regular y aparece el embrión con dos células (blastómeras)).
ANOMALÍAS EN LA FECUNDACIÓN IN VITRO
Las anomalías son más frecuentes.
§ Poliespermia à entrada de más de un espermatozoide dentro del citoplasma del oocito. Muy frecuente en la FIV y muy frecuente en el cerdo. En principio el bloqueo contra la poliespermia funciona pero hay tantos espermatozoides que no puede evitarlos. También se produce por una maduración insuficiente.
§ Poliginia à más de un pronúcleo femenino por no extrusión del primer o segundo corpúsculo polar. Suelen darse en oocitos muy viejos (sobremadurados).
§ Partenogénesis à cuando está en a profase de la primera meiosis, hace mitosis y da un embrión. Se da mucho en la FIV y siempre se pone un control negativo por la partenogénesis. A la hora de fecundarlos, un grupo no se fecunda. En esta gota acostumbra a haber una división. Un estímulo eléctrico al alcohol la activa.
§ Asincronía del desarrollo de pronúcleos à mala maduración citoplasmática. El pronúcleo masculino va a su ritmo, pero la cabeza del espermatozoide no se descondensa. Se da en oocitos inmaduros o sobremadurados,
§ Preactivación de la citocinesis à división del citoplasma antes de la división nuclear.
EVALUACIÓN DE LA FECUNDACIÓN IN VITRO
§ Presencia de los dos corpúsculos polares en el espacio perivitelino. Más del 50% de los corpúsculos polares se desintegran. No es una prueba fiable.
§ División y formación de dos blastómeros de igual medida y forma y sin fragmentos hasta que llegue a mórula y blastocisto. No permite ver anormalidades hasta blastocisto. Sólo dice que hay una fecundación pero no se sabe si es normal o poliploide.
§ Tinciones à permite ver fecundaciones normales o anormales. Es destructiva. Se coge una pequeña fracción de los oocitos y se supone que el resto será más o menos igual.
§ Gestación y nacimiento à es la prueba definitiva.
FACTORES QUE AFECTAN A LA FECUNDACIÓN IN VITRO
SEMEN
Es muy importante el macho. Hay muchas variaciones dentro del macho de la misma especie, dentro de la misma raza y dentro del mismo individuo.
Siempre se hace un pool de machos al hacer la FIV (con 2 ó 3 machos). Es por las variaciones en la composición del plasma seminal.
Sistema de capacitación de los espermatozoides.
Cantidad y calidad de los espermatozoides en el medio de FIV. Se deben tener 3-5 millones de espermatozoides / ml al fecundar. Se debe llegar a un equilibrio.
OOCITO
Origen del oocito: estado hormonal, edad, estímulo hormonal...
Sistema de maduración: fecundación correcta, nuclear y citoplasmáticamente.
Número de oocitos en el medio (suficiente para fecundar pero no bajo porque tendremos poliespermia).
Presencia de células del cúmulus: corrección de deficiencias en el medio de capacitación.
CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES
EMBRIÓN PREIMPLANTACIONAL
El embrión preimplantacional es un embrión que se
encuentra libre de las secreciones oviductales y uterinas. Es con lo que se
trabaja.
Los estadios iniciales están en el oviducto.
Los estadios de mórula se encuentran en el cuerno (inicio). Se buscan aquí. Son blastocitos. Más viables (más estable) y, además, se pueden conseguir mediante un lavado del útero sin llegar a la cirugía.
Se puede manipular el embrión desde el zigoto hasta la implantación y los cuernos uterinos.
FASE PREIMPLANTACIÓN
Hay 4 etapas importantes:
· Fase de segmentación à cultivando las fases mitóticas continuadas à activación del genoma embrionario.
· Fase de compactación à está la determinación, destino de la célula.
· Fase de blastulación à está la diferenciación de diferentes células.
· Fase de eclosión de la zona pelúcida à es la primera etapa de la implantación.
SEGMENTACIÓN
Muchas mitosis continuadas para disminuir la ratio de citoplasma : núcleo, porque el zigoto es la célula mayor del organismo. Se van disminuyendo los tamaños de las células embrionarios hasta o parecerse a una célula nuclear. Aunque se producen las divisiones, no incrementa el tamaño del embrión. No aumenta hasta la fase de blastulación. La zona pelúcida es la envoltura no celular y evita la reacción inmunitaria de la madre y también evita las gestaciones ectópicas a nivel del oviducto.
Las células embrionarias se pueden llamar blastómeras.
Pueden tener embriones de número de células impares porque las divisiones mitóticas no son sincrónicas. Todas esta fase de segmentación se da en el oviducto, en el trayecto del istmo.
Cuando el embrión tiene 8 – 16 células, da la fase de mórula joven. Cuando sigue dividiéndose hasta 32 células, es la fase de mórula.
En esta fase, es muy difícil diferenciar el tipo de especie del embrión y también se parece la evolución en el tiempo. A medida que avanza, se va diferenciando.
Las capas de mucina que se adhieren a la zona pelúcida se dan en conejos, caballos y algunas razas de perro.
El genoma embrionario se activa en rumiantes a las 8 células. Hasta entonces, ha sobrevivido con proteínas y RNA del citoplasma del oocito. Para esta activación el embrión necesita mucha energía y que el desarrollo hasta aquí haya sido óptimo. Hay un cambio de requerimientos metabólicos (del embrión) y cambio de la secreción proteica (del embrión).
Si las condiciones del desarrollo son subóptimas, puede llegar a 8 células y morir aquí.
Ej: cultivos in vitro no muy adecuados, desarrollo del embrión sólo hasta 8 células y se dice que ha sufrido un bloqueo del desarrollo.
Es un parámetro importante para saber si las condiciones de cultivo han sido las idóneas.
Las blastómeras tienen una característica importante puesto que son totipotenciales. Sólo con una célula embrionaria se puede desarrollar un individuo completo.
Ej: 2 células embrionarias à 1 célula y 1 célula por separada dan dos individuos iguales. Se pueden producir clones.
También ocurre igual con un embrión de 4 células y de 8 células y se puede obtener hasta 8 individuos iguales (clones).
No es tan fácil porque las blastómeras tienen un reloj biológico y saben que ya ha pasado las divisiones anteriores. Se llega a un momento en el que se formará un blastocisto. Al tener menos números de divisiones, el blastocisto tiene menos células y menos tamaño. Es muy importante para la implantación.
Es una selección del útero frente a embriones de mala calidad. No se implantarán estos blastocitos de bajo tamaño y bajo número de células.
No se ha demostrado o conseguido 8 individuos de embriones de 8 células. Pero sí si se separan en parejas o grupos de 4.
El concepto de totipotencial de sólo la célula embrionaria se ha puesto en duda con la clonación de Dolly.
COMPACTACIÓN
Es la fase de mórula compacta.
Se produce en el oviducto o útero.
La compactación se da en el ratón a las 16 células.
Las células embrionarias se unen unas a otras para hacer una estructura global. Es difícil diferenciar los límites entre las células. Se forman uniones estrechas entre las células externas.
Esta unión de células estrechas de células externas aísla las células internas de las exteriores. Todo lo que viene del exterior pasa el filtro de las células estrechas.
Estas células externas tienen una polarización (el núcleo y orgánulos van a la parte basal). Comienza la determinación.
· Células externas à membranas extraembrionarias à TROFOBLASTO.
· Células internas à embrión à BOTÓN EMBRIONARIO o MASA CELULAR INTERNA.
Todavía no hay diferenciación celular, lo que la determina es su localización dentro del embrión.
BLASTULACIÓN
Es necesaria la compactación previa, en la que el espacio perivitelino aumenta.
Es una etapa importante porque es una segunda etapa que indica viabilidad. Si llegamos a blastocisto, se considera el medio óptimo el ideal.
Si es “in vivo”, la transferencia tendrá casi seguro el 100% de éxito.
En bovino, el primer día tras la inseminación artificial, será cuando se cogen los embriones, porque ya estarán en el cuerno del útero.
Se obtienen por lavado.
Dentro del mismo animal, unos embriones entran en el cuerno del útero antes y otros entran más tarde. Normalmente suelen entran a los 4-5 días post inseminación artificial o post monta.
La blastulación tiene lugar en el útero y se debe esperar al 6º o 7º día.
Se forma una cavidad de líquido en el interior del embrión (Blastocele). El líquido es rico en aminoácidos, factores de crecimiento (estrógenos), nutrientes para las células internas...
Ayudan a las células externas a formar el blastocele porque forman la barrera y seleccionan la entrada de nutrientes para células internas. Hay entrada de Na+ y después de líquidos.
A partir de blastocisto hay un incremento del tamaño del embrión. Aquí empieza la diferenciación y comienzan las líneas celulares diferentes:
-Células internas à masa celular interna.
-Células externas à trofoblasto.
Aquí se acabará la totipotencialidad porque ya son células diferentes.
La masa celular interna es la más sensible y la más importante porque dan el embrión.
Si la congelación sólo afecta a las células internas, hay una implantación y crece el blastocisto pero las células internas están muertas.
El blastocisto aparece cuando se forma el blastocele (cavidad llena de líquido). Las células que contactan con el blastocele son las de la masa interna. Las células de fuera son las de la membrana del embrión. Este estadio se busca en el bovino. El blastocisto es más estable que la mórula porque el blastocele demuestra que tiene viabilidad. Este blastocele va incrementando de tamaño por el líquido por agua, estrógenos, factores de crecimiento que nutren a las células de la capa interna.
La membrana pelúcida se va adelgazando por la presión física del embrión. Cada vez se va incrementando y va disminuyendo el grosor de la zona pelúcida.
Cuando se rompe la zona pelúcida se da la eclosión. El embrión se deshace de la zona pelúcida por dos actividades: física (crecimiento y debilidad) y química (secretan proteasas que van degradando la zona pelúcida). Van debilitando la zona pelúcida hasta que se pueda desprender porque ya no tiene funcionalidad (sólo evita la gestación ectópica del embrión al oviducto, pero nos encontramos en el útero y se debe implantar).
En un polo se encuentra la masa celular interna à polo animal.
El polo opuesto es el polo vegetativo.
La eclosión presenta diferencias. Se da eclosión en bovino entre 8-10 días postinseminación artificial. Es un estadio muy frágil y se debe evitar el recuperar este embrión porque se romperá al hacer el flushing (lavado con sonda Foley). Se debe recoger antes. Por eso siempre se hace el 6’5 (terneras)-7 día postinseminación artificial.
Tras esta eclosión se da el alargamiento del blastocisto. Las membranas extraembrionarias llegan a los dos cuernos porque el embrión se alarga (sobretodo el trofoblasto). Este alargamiento sobretodo se da en rumiantes y cerdos. El blastocisto de los équidos incrementa de tamaño y volumen después de cierto tiempo. Más tarde se alarga. Por eso se puede ver en el 10.11 día porque es de gran tamaño.
TRANSPORTE EMBRIONARIO
A nivel oviductal se da de forma diferente según las especies. Va descendiendo progresivamente en el conejo y cerdo. En los rumiantes y primates, el descenso es discontinuo. Se debe buscar en la unión ampuloístmica durante 2-3 días y después bajan rápidamente hacia el útero.
La entrada al útero tiene lugar entre el tercer y quinto día postinseminación artificial. En los bovinos sobretodo el quinto día. Las especies más pequeñas llegan al tercer día postinseminación. Dentro del útero, el embrión se debe desplazar al lugar de implantación (migración hacia el sitio de implantación). Generalmente se implanta en la mitad del cuerno ipsilateral al cuerpo lúteo. Esta migración permite encontrar implantaciones hasta del 30% en el cuerno controlado en el cuerpo lúteo. El embrión dentro del útero está en continuo movimiento. Se nutre y se mueve por las secreciones uterinas. Cuando una especie es politoca (diferentes individuos en el parto), además de la implantación, tiene un equidistanciamiento. Se separan los embriones y tienen una distancia similar por las ondas uterinas que hace el embrión.
Por mucho que se quiera incrementar la prolificidad del cerdo, siempre se tiene la limitación del espacio uterino.
En el momento de la eclosión, tiene lugar el reconocimiento de la gestación por parte de la madre. Se reconoce diferentemente en diferentes especies:
· Équidos à el embrión indica que está vivo desplazándose por los dos cuernos uterinos de forma continua. Indica su presencia por el contacto con la mucosa uterina. Evita la secreción de PGF2a que eliminaría el cuerpo lúteo.
· Bóvidos à no pasa eso porque el blastocisto se elonga y pierde la capacidad de moverse. Secreta interferón tau o trofoblastina que informa a las células uterinas de su presencia y estas células uterinas bloquean los receptores de oxitocina que son los responsables de la formación de PGF2a.
Cuando se hace una transferencia de embriones, se debe mirar que el ambiente uterino y la edad del embrión sean sincrónicos. Hace falta una sincronía entre la edad del embrión y el desarrollo del útero. Las hembras deben estar estimuladas hormonalmente para ovular y la transferencia se debe hacer al mismo estadio. Asincronías de +24 horas se pueden hacer con una fertilidad adecuada. Si la diferencia es >48 horas, la tasa de implantación es nula. Cualquier manipulación de un embrión significa una grave disminución de la fertilidad.
En los embriones congelados, la fertilidad del 50% es buena. En embriones frescos, la fertilidad del 60% es buena. A mejor calidad morfológica del embrión, mejora el desarrollo. Si el embrión es simétrico en color, forma, sin células extruídas, es un embrión excelente o perfecto. Tiene la máxima efectividad. También se pueden transferir embriones buenos (sólo tienen una alteración: no es esférico, alguna célula extruída). Se puede transferir y la tasa de gestación es elevada. No se aconseja transferir embriones con más de una alteración. Son embriones regulares. Si se pierde toda viabilidad, es degenerado. La calidad morfológica es importante para establecer qué embriones transferir. Bastantes embriones son malos y se debe discriminar los que se transfieren. Se mejoran los resultados sabiendo discriminar cuál es bueno y cuál es malo.
Muchas veces pueden haber gestaciones vacías porque la masa celular interna está muerta. Otro problema es que el feto es gigante y debe salir por cesárea y tienen anomalías congénitas. Se atribuye al efecto de mantenimiento in vitro sobre la masa celular interna.
CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES
Es una herramienta que puede ser usada para otras técnicas. Es el mantenimiento extramaterno de los embriones por un periodo limitado de tiempo. Permite conservar los embriones, pero no para el metabolismo. El periodo de mantenimiento es limitado. Criocongelando se puede hacer una conservación ilimitada. Al principio fue muy usada para separar el tiempo de la recuperación y la transferencia de estos embriones. Ej: obtenerlos en una granja y llevarlos a otro sitio. Se deben cumplir unas necesidades para hacer el traslado.
Generalmente es bastante fácil de hacer. Se hace en la práctica habitual. Es más difícil mantenerlos durante bastantes días. Se puede querer hacer para conseguir embriones que se puedan transferir no quirúrgicamente. Se debe esperar 8-10 días hasta tener un blastocisto.
También para evaluar la viabilidad embrionaria tras otra manipulación.
En la clonación se debe transferir el núcleo y después ver si es viable.
Se diferenciará:
-Mantenimiento corto à horas à mantenimiento in vitro.
-Mantenimiento largo à días à cultivo in vitro.
MANTENIMIENTO IN VITRO
Es sencillo tecnológicamente. Se debe mantener el pH constante usando tampones fosfato (medio PBS). Se debe usar el medio líquido con PBS. Siempre deben estar bañados en medio líquido. La temperatura debe ser estable entre 37 y 39ºC. La osmolaridad se debe mantener constante (=300 mOsm). La humedad debe mantenerse para no incrementar la osmolaridad. El embrión tiene capacidad de respuesta osmótica. Se debe añadir al medio una fuente proteica que actúe como macromolécula. Generalmente la más usada es el suero fetal bovino (FCS) para todas las especies. Esta macromolécula hace que el embrión no quede enganchado en el suelo de la placa de cultivo. Compensa las cargas eléctricas del embrión. A veces se usa la albúmina sérica bovina.
Además de actuar como macromolécula, tiene ciertos componentes que nutren al embrión. Para asegurarnos que tienen contenido alimenticio, se puede añadir glucosa y piruvato. La contaminación del medio es posible y se añaden antibióticos y antimicóticos al medio para asegurar que no se pasa contaminación. Generalmente este medio de cultivo ya se puede comprar de forma comercial.
CULTIVO IN VITRO
Para hacer cultivo in vitro largo, se complica porque el tampón fosfato ya no es útil (sólo sirve para 24 h y después pierde la viabilidad). El tampón corporal es el bicarbonato. Para cultivarlos se necesitan unas incubadoras que tengan una atmósfera controlada aislada del exterior. Debe permitir la entrada de CO2 al 5% continuamente para evitar que el CO2 del bicarbonato salga al aire.
Generalmente se usa una atmósfera con un 5% de CO2 al aire. Debe ser estanco y permitir la entrada de CO2. Actualmente existen incubadoras portátiles no muy caras.
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